![]() | ブロッティングしたフィルターとプローブを混合し相補鎖同志の結合を行わせます。最近感度の高いプローブが工夫されています。基本は32P標識ですが、ビオチン標式、ジゴキシゲニン標識等色々あります。それぞれの標識法にもとづき、オートラジオグラフィー、発色または発光が利用できます。 プローブの合成は普通、DNA合成反応で行います。ニックトランスレーションやランダムプライマー法が一般的です。場合によってはPCRをつかってプローブ合成することもあります。また、オリゴヌクレオチドプローブも可能です。これですとテンプレートを必要とせず、純粋に化学合成で作成できます。 プローブの長さ、すなわち、何塩基あれば目的の遺伝子のみを検出する特異的なプローブとなるかですが,リピート領域でなければ20baseもあれば充分です。PCRのプライマーだって20base前後でback ground なくDNA合成するのですから。 プローブと標的DNA間で相補鎖同志が結合します。A−T、G−Cでそれぞれ水素が2つと3つの水素結合です。従って高温だとはずれやすく、低温だと多少まちがっていても結合したままとなります。又、塩濃度をあげれば、はなれやすくなります。ホルムアミドを加えてもTmが低下します。実験室でそれぞれback ground が低く、しかし濃いバンドが得られる条件を捜す必要があります。Back ground を減らすためのブロッキングですがDenhard't solution やスキムミルクを使用します。 |