β分画の２峰性

発表者：株式会社常光

１．はじめに

　セルロース・アセテート膜（セ・ア膜）電気泳動法による蛋白分画において、β分画が２峰性を示すことがあります。

β分画の２峰性：
両端に泳動したコントロール血清以外の全ての検体でβ分画２峰性が出現

　新鮮血清測定時によく見られるこの現象は、補体成分であるＣ３ｃがslow-β部位に泳動されることに起因しており、病態解析においてＭ蛋白との誤認を引き起こす「Ｍ蛋白様バンド」の原因のひとつとなっています。

　橋本ら^１）　は、２峰性βの原因を、ブリッジング用濾紙に由来するＣａイオンであると報告しました。
　各自動機メーカーでは、自動機のブリッジング用濾紙をスポンジに変えることによって対応しましたが、濾紙を用いていない自動機でもこの現象が発生していました。また、本現象の発生頻度は一様ではありませんでした。メンテナンス直後に発生しやすいとの情報もありましたが、発生しないユーザーも多かったのです。

　そこで、自動機におけるβ分画２峰性の原因およびその対処法について検討し、報告させていただきました。

２．使用した試薬・機材

・全自動電気泳動装置：ＣＴＥ－８０００およびＡＬＣ－７６０（常光）
　泳動電流　０.９mA/cm
　泳動時間　１５分
　染色時間　６０秒（ＣＴＥ）・９０秒（ＡＬＣ）
　脱色回数　３回
　※泳動槽およびスポンジは超純水で洗浄後、緩衝液に浸してから使用

・セルロース・アセテート膜：セパラックス－ＳＰ（富士写真フィルム）

・泳動用緩衝液：ベロナール・ベロナールソーダ　ｐＨ８.６　μ＝０.０５

・染色液：ポンソーＳ

・脱色液：１％酢酸

・免疫固定法用抗体：抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社）

・Ｃａ測定装置：カルシウム-マグネシウムメータ　Ca-Mg30/20　（常光）

・検体：採血直後に分離・凍結保存しておいたヒト血清を、用時融解して使用

３．Ｃａイオンが泳動像に及ぼす影響

　まず、自動機におけるβ分画２峰性の原因がＣａイオンであるかを確認するため、塩化カルシウムを添加した緩衝液で泳動を行いました。
　その結果、０.１０mM　のＣａイオン添加緩衝液使用で本現象が観察されました。また、０.１０mM以上の濃度では添加量が増えるに従い、Ｃ３ｃバンドの移動度が遅くなるという傾向が促進されました。

　橋本ら^１）　の報告すなわち用手法においては、１.５mMのＣａイオン添加により初めてβ分画２峰性が観察されたにも関わらず、自動機においては０.１０mMのＣａイオン添加でも本現象が確認されました。本現象は自動機でより出現しやすいと考えられます。

Ｃａイオンの影響

４．Ｃａイオンキレート剤　ＥＤＴＡ-２Ｎａの添加

　Ｃａイオンなど、２価の金属イオンとキレート錯体を形成するエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を緩衝液に添加^２）　し、本現象の発生頻度を検討しました。
　大竹ら^３）　により、０.８mMのＥＤＴＡを添加した場合、各分画の泳動位置が異なるという報告がなされていたため、今回、ＥＤＴＡ濃度をその半分の０.４mMとしました。

　その結果、ＥＤＴＡ未添加緩衝液使用時には２０検体中１６検体がβ分画２峰性を示したにも関わらず、ＥＤＴＡ添加緩衝液使用時に本現象を示す検体は確認されませんでした。
　また、０.４mMのＥＤＴＡを添加した場合と添加していない場合のデンシトグラムパターンを比較したところ、分画値％において各分画とも非常によい相関性が得られました。

EDTA-2Na添加緩衝液使用時の泳動パターン

EDTA-2Na未添加緩衝液使用時の泳動パターン

５．免疫固定法を用いたβ分画の検討

　免疫固定法を用い、Ｃａイオンの、補体成分Ｃ３ｃの挙動に及ぼす影響を検討しました。
　４症例の検体を、１.５mMＣａ添加緩衝液およびＥＤＴＡ添加緩衝液の２条件で泳動し、ＤＡＫＯ社製の抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギ抗体を用いた免疫固定および通常のたんぱく染色を行いました。

表　免疫固定法の手順

通常法と同様に泳動
　↓
膜を取り出す
　↓
　予め抗血清を含ませておいたセ・ア膜片を泳動膜上に貼りつける　
　↓
３７℃、１時間反応
　↓
反応終了後、生理食塩水で膜を洗浄
　↓
ポンソーＳで染色

　免疫固定の結果、Ｃａ添加緩衝液使用時には、２本のバンドが認められ、β分画は薄く、slow-β分画は濃く染色されました。また、ＥＤＴＡ添加緩衝液使用時にも、２本のバンドが認められましたが、α_２分画が薄く、β分画が濃く染色されました。もちろんタンパク染色ではＣａ添加緩衝液使用時にβ分画２峰性が認められています。

　本結果から、Ｃａイオンの存在が、補体成分Ｃ３ｃの移動度に影響を及ぼすことが確認されました。

６．Ｃａ濃度の測定

　自動機におけるＣａイオンの由来について検討しました。

　まず、緩衝液製造用イオン交換水および未使用緩衝液のＣａ濃度を測定しましたが、Ｃａはほとんど含有されていませんでした。一方、泳動後の緩衝液や水道水には高濃度Ｃａが含有されていたため、我々は自動機のメンテナンスに注目しました。

サンプル	総Ｃａ濃度
緩衝液製造用　　イオン交換水	0.003 mmmol/L
未使用緩衝液	0.003 mmmol/L
超純水	0.003 mmmol/L
使用後緩衝液	0.100 mmmol/L
水道水	0.600 mmmol/L

　測定装置：カルシウム-マグネシウムメータ　Ca-Mg30/20（常光）
　測定原理：ＥＤＴＡ直接滴定法（指示薬　カルセイン）　　　　　　　

７．現在の日常保守における泳動槽の清掃方法

　現在、日常保守における泳動槽の清掃方法は以下のようになっております。

表　ＣＴＥシリーズのメンテナンス方法：使用説明書より抜粋

機種	清掃方法
ＣＴＥ－１５０	搬送台、ブリッジ用スポンジとスポンジ台を外した後、槽内の栓を抜き緩衝液を排出、続いて泳動槽を外す。　泳動槽、スポンジ、スポンジ台を水洗いし日陰で乾燥させる。　乾燥して堅くなったスポンジを緩衝液に漬け柔らかくしておく。　泳動槽を装置にセットし、緩衝液を注入する。　スポンジを軽く絞りスポンジ台に乗せ、泳動槽にセットする。　スポンジの上から緩衝液を注ぎ、スポンジに充分含ませる。
上記以外のＣＴＥシリーズ	泳動槽内のゴム栓をとり緩衝液を排出する。　膜補正板、スポンジ台、スポンジブロックを取り出し水洗いする。スポンジブロックはよくもみ洗いする。　泳動槽内の緩衝液をきれいに拭き取る。　スポンジブロックに残っている水を取り去るため、緩衝液でしめらせた後、軽く絞る。　ゴム栓、膜補正板、スポンジ台、スポンジブロックをセットし、泳動槽蓋を閉じ緩衝液を注入する。

　このように泳動槽の洗浄には水道水が用いられており、水道水中のＣａイオンが混入している可能性があると思われました。

８．スポンジ洗浄法によるＣａイオン濃度の変動

　水道水を用いたスポンジ洗浄法および水道水を用いないスポンジ洗浄法として、以下の４通りの方法を行い、泳動槽内緩衝液中のＣａ濃度を測定しました。

洗浄方法	泳動槽緩衝液中のＣａ濃度
方法１　水道水で洗浄後、緩衝液に浸してからよく絞り、泳動槽にセットする	0.10 mmol/L
方法２　水道水で洗浄後、完全に乾燥させてから泳動槽にセットする	0.10 mmol/L
方法３　超純水で洗浄後、緩衝液に浸してからよく絞り、泳動槽にセットする	0.03 mmol/L
方法４　超純水で洗浄後、完全に乾燥させてから泳動槽にセットする	0.07 mmol/L

　洗浄の丁寧さや、スポンジに残る水分量の差などによりこの測定値は変動するものと思われますが、水道水で洗浄を行った場合はどちらの方法を用いてもＣａ含有量は増加する傾向が見られました。

９．スポンジ洗浄法によるβ分画２峰性の比較

　方法１と３については実際に泳動を行い、泳動パターンを比較しました。その結果、方法１の水道水でスポンジ洗浄を行った場合はβ分画２峰性が確認され、方法３の超純水でスポンジ洗浄を行った場合、本現象は確認されませんでした。方法１の場合のＣａ濃度は０.１mM、方法３の場合のＣａ濃度は０.０３mMですので、検討１で述べた内容すなわち０.１mM以上のＣａイオン存在時に本現象が確認されるという結果と一致します。

方法１：水道水で洗浄後、緩衝液に浸してからよく絞り、泳動槽にセットする

方法３：超純水で洗浄後、緩衝液に浸してからよく絞り、泳動槽にセットする

１０．まとめ

１）　電気浸透の影響を受けない支持体の開発や、自動機の性能向上に伴い、今までは判別・判読できなかったバンドの認識が可能になりました。その反面、病態解析におけるＭ蛋白との誤認も発生しています。補体バンドの出現によるβ分画の２峰化も、Ｍ蛋白様バンドの１つです。

２）　用手法における本現象の原因がブリッジング用濾紙に由来するＣａイオンであるとする報告^１）　がありますが、ブリッジング用濾紙を用いていない自動機でも本現象は発生しています。本現象の発生頻度は一様ではありません。また、メンテナンス直後に発生しやすいとの情報もありましたが、発生しないユーザーが多いことも事実です。

３）　今回の検討で、本現象の原因はやはりＣａイオンであり、その由来が泳動槽及び泳動用スポンジ洗浄時の水道水であることが判明しました。水道水に含まれるＣａイオンは地域や建造物によって異なり、また、メンテナンス方法によってもその混入に差が生じているものと考えられます。

４）　現在、装置の維持はユーザーに多くを依存していますが、ブリッジ剤に付着するヌメリが泳動像のゆがみの原因となることが多く、自動機の日常保守におけるスポンジ洗浄は必須項目です。今後、当社としては、日常保守におけるスポンジ及び泳動槽の洗浄にはイオン交換水等を使用する、という内容を注意事項に明記し、ユーザーにも励行していただくようお願いしていく方針です。

　また、なぜ補体Ｃ３ｃのみがＣａイオンの影響を強く受けるのかについての報告はいまだなされておらず、引き続き検討していく必要があると考えます。

　
　自動機におけるβ分画２峰性　

　　　原因：Ｃａイオンによる補体成分・Ｃ３ｃバンドの出現　　　　　

　　　由来：泳動槽・スポンジ台・スポンジ・洗浄時に用いる水道水　
　

　
　対処方法　

　　泳動槽、スポンジ台およびスポンジの洗浄には　　　　　　　　　

　　イオン交換水や超純水など、Ｃａイオンを含まない水を用いる　　
　

　参考文献

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